Extraneural Pathologic Prion Protein in Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease ad

Z największą ostrożnością uniknięto zanieczyszczenia próbek pozanabłonowych tkanką centralnego układu nerwowego. Wszystkie tkanki zostały przetworzone zgodnie z ustalonymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa i etyki. Wykrywanie PrPSc w tkankach zewnątrznosowych
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone na urządzeniach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 przy ścisłym przestrzeganiu wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Metoda wytrącania za pomocą kwasu fosfowolframowego sodu została zaadaptowana z opublikowanych protokołów.8 Przygotowaliśmy 10 procent homogenatów tkankowych (waga na objętość) w 2 procentach sarkosylu w sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, stosując RiboLyser (Hybaid). Pozostałości komórkowe usunięto przez odwirowanie przy 80 x g przez jedną minutę w mikrowirówce. Sporadyczne szczątkowe pozostałości usunięto przez dodatkowe odwirowanie przy 2700 xg przez pięć minut. Supernatanty (500 .l) zmieszano z równymi objętościami 2% sarkosylu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i inkubowano przez 10 minut w 37 ° C. Dodano benzonazę (nukleaza Benzon, Merck) i chlorek magnezu (stężenie końcowe, odpowiednio 50 jednostek na mililitr i mmol na litr) i mieszaninę inkubowano w ciągłym mieszaniu przez 30 minut w 37 ° C.
Próbki doprowadzono do końcowego stężenia 0,3 procentowego fosforo-stearynianu, inkubowano w 37 ° C przez 30 minut przy stałym mieszaniu i wirowano przy 15 800 x g przez 30 minut w mikrowirówce. Osady ponownie zawieszono w 20 .l soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 0,1% sarkozylu. Próbki doprowadzono do końcowego stężenia 20 .g proteinazy K na mililitr i inkubowano w 37 ° C przez 30 minut. Trawienie zakończono przez dodanie inhibitorów proteazy (kompletny koktajl inhibitorowy proteazy, Boehringer Mannheim). Próbki gotowano w buforze obciążającym (125 mM TRIS chlorek sodu, 4 procent dodecylosiarczanu sodu, 20 procent glicerolu i 0,02 procent błękitu bromofenolowego), poddano elektroforezie w 12 procentach żeli TRIS-glicynowych i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Membrany zablokowano 5-procentowym Topblockiem (Jura) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 0,05% Tween, a następnie inkubowano przez noc z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko PrP (3F4, rozcieńczenie 1: 5000) .12
Następnie próbki inkubowano ze skoniugowanym z alkaliczną fosfatazą drugorzędowym przeciwciałem (1: 20 000) i badano przy użyciu 2-chloro-5- (4-metoksyspiro {1,2-dioksan-3,2 – (5 – chlor) trójcyklowy [3.3.1.13,7] dekan} -4-ylo) -1-fenylofosforanowy substrat chemiluminescencyjny soli sodowej (Amersham) i cyfrowy przyrząd do obrazowania VersaDoc (model 5000, Bio-Rad). Każdy test zawierał odpowiednie pozytywne i negatywne kontrole (10 .g lub 100 .g homogenatu mózgu od pacjenta ze sporadyczną chorobą Creutzfeldta-Jakoba lub pacjenta bez choroby prionowej dodanej do 50 mg próbki mięśniowej lub śledziony od pacjenta bez choroby prionowej) . Wszystkie analizy zostały przeprowadzone, a wszystkie z wyjątkiem sześciu próbek zostały zbadane co najmniej dwa razy przez niezależnych badaczy. Próbki uznano za pozytywne, jeśli jednoznacznie zidentyfikowano oporne na proteinazę K diglikozylowane, monoglikozylowane i nieglikozylowane prążki o ruchliwości elektroforetycznej wskazującej PrPSc.
Wykrywanie PrPSc w tkankach nerwowych
Analizę Western blot przeprowadzono tak, jak opisano poprzednio.13 Proteformy PrP oznaczono ilościowo za pomocą stacji obrazowej Kodak (model 440) lub cyfrowego aparatu fotograficznego VersaDoc (model 5000), a pacjenci zostali wpisani zgodnie z wielkością rdzenia opornego na proteazę. Fragment PrP14 i częstość występowania glikoform 15, 16
Analiza genetyczna
Genomowy DNA ekstrahowano z zamrożonych tkanek
[patrz też: stomatolog toruń cennik, półpasiec ile trwa, rezonans magnetyczny kręgosłupa cena ]
[podobne: stomatolog toruń cennik, kalbi kalendarz dni płodnych, doreta cena ]